A nuestro alrededor hay muchos héroes anónimos que parecen ordinarios, pero que en realidad contribuyen enormemente a nuestro bienestar. La proteinasa K es un ejemplo de ello en la industria del diagnóstico molecular. Comparada con las grandes empresas del sector, su importancia ha sido tan discreta que durante mucho tiempo la hemos pasado por alto. Con el brote de la pandemia de COVID-19, la demanda de proteinasa K se disparó, y la oferta, tanto nacional como internacional, quedó muy por debajo del consumo. De repente, todos se dieron cuenta de la importancia de la proteinasa K.
¿Para qué sirve la proteinasa K?
La proteinasa K es una serina proteasa con actividad enzimática proteolítica y puede mantener su actividad en un amplio rango de entornos (pH (4-12,5), tampón de alta concentración salina, alta temperatura de 70 °C, etc.). Además, la actividad de la proteinasa K no se inhibe por SDS, urea, EDTA, clorhidrato de guanidina, isotiocianato de guanidina, etc., y una cierta cantidad de detergente también puede potenciar su actividad. La proteinasa K tiene aplicaciones en tratamientos médicos (desinfección de virus y microorganismos), alimentos (ablandamiento de carne), cuero (suavizado del cabello), vinicultura (clarificación de alcohol), preparación de aminoácidos (plumas degradadas), extracción de ácidos nucleicos, hibridación in situ, etc. La aplicación más común es la extracción de ácidos nucleicos.
La proteinasa K puede enzimolizar todo tipo de proteínas en la muestra, incluidas las histonas fuertemente unidas a los ácidos nucleicos, liberando así estos últimos del extracto y facilitando la siguiente etapa de extracción y purificación. En la detección de ácidos nucleicos virales, la proteinasa K es un componente importante en la solución de muestreo viral. La proteinasa K puede romper e inactivar la proteína de la cápside del virus, lo que resulta más seguro durante el transporte y la detección. Además, la proteinasa K también puede degradar la RNasa, previniendo la degradación del ARN viral y facilitando la detección de ácidos nucleicos.
La fama repentina de la proteinasa K
Tanto en la investigación científica como en el diagnóstico in vitro, la extracción de ácidos nucleicos es un procedimiento fundamental, por lo que la proteinasa K siempre ha sido esencial. Sin embargo, en el pasado, su función era mucho menos conocida. Esto se debía, en gran medida, a la gran estabilidad de la relación entre la oferta y la demanda de proteinasa K. Pocos pensaban que el suministro de proteinasa K pudiera ser un problema.
Con el brote de la pandemia del nuevo coronavirus, la demanda de pruebas de ácido nucleico se disparó. A finales de junio de 2020, China había realizado casi 90 millones de pruebas, una cifra aún más alarmante a nivel mundial. En los experimentos de extracción de ácido nucleico, la concentración de trabajo de la proteinasa K es de aproximadamente 50-200 μg/mL. Generalmente, se necesitan unos 100 μg de proteinasa K para extraer una muestra de ácido nucleico. En la práctica, para aumentar la eficiencia de la extracción, a menudo se utiliza una mayor cantidad de proteinasa K. La detección del nuevo coronavirus mediante ácido nucleico generó una gran demanda de proteinasa K. El equilibrio original entre la oferta y la demanda de proteinasa K se rompió rápidamente, y esta se convirtió de la noche a la mañana en un material importante para la prevención de epidemias.
Dificultades en la producción de proteinasa K
Si bien con el desarrollo de la epidemia se ha reconocido la importancia de la proteinasa K, resulta lamentable que, debido a su escasa difusión, pocas empresas nacionales se hayan involucrado en su producción. Al intentar establecer una planta de producción de proteinasa K, durante el proceso se descubrió que se trata de una proteína muy especial. Ampliar la capacidad de producción de proteinasa K en un corto período de tiempo representa un gran desafío.
La producción a gran escala de proteinasa K se enfrenta a las siguientes dificultades.
1. Baja expresión
La proteinasa K puede degradar de forma inespecífica la mayoría de las proteínas y causar una toxicidad grave en la célula huésped. Por lo tanto, su nivel de expresión suele ser muy bajo. La selección de sistemas de expresión y cepas con alta expresión de proteinasa K generalmente requiere un ciclo más prolongado.
2. Residuos de pigmentos y ácidos nucleicos
La fermentación a gran escala introduce una gran cantidad de pigmentos y residuos de ácidos nucleicos del huésped. Resulta difícil eliminar estas impurezas mediante un proceso de purificación sencillo, y una purificación compleja aumenta el coste y reduce la tasa de recuperación.
3. Inestabilidad
La proteinasa K no es lo suficientemente estable, puede autodestruirse y resulta difícil almacenarla de forma estable a 37 °C durante mucho tiempo sin un agente protector.
4. Fácil de precipitar
Al preparar el polvo liofilizado de proteinasa K, para asegurar que el contenido de sólidos de proteinasa K en el polvo liofilizado sea elevado, es necesario añadir un agente protector de liofilización en alta concentración. Sin embargo, cuando la concentración de proteinasa K alcanza los 20 mg/ml o más, se produce fácilmente la agregación que forma un precipitado, lo que dificulta enormemente la liofilización de la proteinasa K con un alto contenido de sólidos.
5. Gran inversión
La proteinasa K posee una fuerte actividad proteolítica y puede hidrolizar otras proteasas en el laboratorio. Por lo tanto, su investigación, desarrollo y producción requieren áreas de producción, equipos y personal especializados.
Solución de proteinasa K de XD BIOCHEM
XD BIOCHEM cuenta con una plataforma madura de expresión y purificación de proteínas, y posee una amplia experiencia en la expresión y purificación de proteínas recombinantes y en la optimización de procesos de producción. Gracias a la rápida formación de un equipo de investigación y desarrollo, se ha superado el proceso de producción a gran escala de proteinasa K. La producción mensual de polvo liofilizado supera los 30 kg. El producto presenta un rendimiento estable, una alta actividad específica de la enzima y no contiene residuos de citocromo huésped ni de ácidos nucleicos. Le invitamos a contactar con XD BIOCHEM para obtener un paquete de prueba (Correo electrónico:sales@xdbiochem.comTel.: +86 513 81163739).
Las soluciones técnicas de XD BIOCHEM incluyen:
Mediante la integración de plásmidos multicopia, se seleccionan cepas de alta expresión con un nivel de expresión de 8 g/L, lo que soluciona el problema del bajo nivel de expresión de la proteinasa K.
Mediante el establecimiento de un proceso de purificación en varias etapas, se logró eliminar con éxito el citocromo huésped y los residuos de ácido nucleico de la proteinasa K, reduciéndolos a un valor inferior al estándar.
Mediante un cribado de alto rendimiento de formulaciones de tampón protector, se seleccionó un tampón capaz de almacenar de forma estable la proteinasa K a 37 °C.
El uso de tampones de cribado soluciona el problema de que la proteinasa K se agregue y precipite fácilmente a altas concentraciones, y sienta las bases para la liofilización de la proteinasa K con alto contenido de sólidos.
Muestra de proteinasa K de XD BIOCHEM
Prueba de estabilidad de la proteinasa K de XD BIOCHEM: no habrá cambios significativos en la actividad después de 80 días a temperatura ambiente.
Prueba de estabilidad de la proteinasa K de XD BIOCHEM: no habrá cambios significativos en la actividad después de 80 días a temperatura ambiente.
Comparación del efecto de extracción de ácidos nucleicos de la proteinasa K de XD BIOCHEM y productos de la competencia. En el proceso de extracción de ácidos nucleicos, se utilizaron respectivamente la proteinasa K de XD BIOCHEM y una proteinasa K de la competencia. La eficiencia de extracción de la proteinasa K de XD BIOCHEM es mayor y el valor Ct del gen objetivo es menor.
Fecha de publicación: 31 de diciembre de 2021