El IPTG (isopropil-β-D-tiogalactósido) es un análogo del sustrato de la β-galactosidasa, altamente inducible. Bajo la inducción del IPTG, el inductor puede formar un complejo con la proteína represora, modificando así la conformación de esta última e impidiendo su unión al gen diana, lo que resulta en una expresión eficiente del mismo. Entonces, ¿cómo se debe determinar la concentración de IPTG durante el experimento? ¿A mayor concentración, mejor?
Primero, entendamos el principio de inducción de IPTG: el operón de la lactosa de E. coli contiene tres genes estructurales, Z, Y y A, que codifican la β-galactosidasa, la permeasa y la acetiltransferasa, respectivamente. lacZ hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa, o en alolactosa; lacY permite que la lactosa del ambiente atraviese la membrana celular y entre en la célula; lacA transfiere el grupo acetilo del acetil-CoA al β-galactósido, lo que implica la eliminación del efecto tóxico. Además, existe una secuencia operadora O, una secuencia de inicio P y un gen regulador I. El gen I codifica una proteína represora que puede unirse a la posición O de la secuencia operadora, de modo que el operón (meta) se reprime y se desactiva. También existe un sitio de unión para la proteína activadora de genes catabólicos (CAP) aguas arriba de la secuencia de inicio P. La secuencia P, la secuencia O y el sitio de unión de CAP constituyen conjuntamente la región reguladora del operón lac. Los genes que codifican las tres enzimas están regulados por la misma región reguladora para lograr la expresión coordinada de los productos génicos.
En ausencia de lactosa, el operón lac (meta) se encuentra en estado de represión. En este momento, el represor lac expresado por la secuencia I bajo el control de la secuencia promotora PI se une a la secuencia O, lo que impide que la ARN polimerasa se una a la secuencia P e inhibe el inicio de la transcripción; cuando hay lactosa presente, el operón lac (meta) puede ser inducido. En este sistema de operón (meta), el verdadero inductor no es la lactosa en sí. La lactosa entra en la célula y es catalizada por la β-galactosidasa para convertirse en alolactosa. Esta última, como molécula inductora, se une a la proteína represora y cambia su conformación, lo que lleva a la disociación de la proteína represora de la secuencia O y a la transcripción. El isopropiltiogalactósido (IPTG) tiene el mismo efecto que la alolactosa. Es un inductor muy potente, que no es metabolizado por las bacterias y es muy estable, por lo que se utiliza ampliamente en laboratorios.
¿Cómo determinar la concentración óptima de IPTG? Tomemos como ejemplo la bacteria E. coli.
La cepa de E. coli BL21 modificada genéticamente que contiene el plásmido recombinante positivo pGEX (CGRP/msCT) se inoculó en medio líquido LB que contenía 50 μg·mL-1 de Amp y se cultivó durante la noche a 37 °C. El cultivo anterior se inoculó en 10 frascos de 50 mL de medio líquido LB fresco que contenía 50 μg·mL-1 de Amp en una proporción de 1:100 para el cultivo de expansión, y cuando el valor de OD600 fue de 0,6~0,8, se añadió IPTG a la concentración final. Es 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1. Tras la inducción a la misma temperatura y durante el mismo tiempo, se extrajo 1 ml de la solución bacteriana, se recogieron las células bacterianas mediante centrifugación y se sometieron a SDS-PAGE para analizar la influencia de diferentes concentraciones de IPTG en la expresión de proteínas, y posteriormente se seleccionó la concentración de IPTG con la mayor expresión de proteínas.
Tras los experimentos, se observará que la concentración de IPTG no debe ser tan alta como se desearía. Esto se debe a que el IPTG presenta cierta toxicidad para las bacterias. Un exceso de concentración también puede matar la célula. En general, se espera que cuanta más proteína soluble se exprese en la célula, mejor, pero en muchos casos, cuando la concentración de IPTG es demasiado alta, se forma una gran cantidad de inclusiones en el cuerpo celular, pero la cantidad de proteína soluble disminuye. Por lo tanto, la concentración más adecuada de IPTG no suele ser la más alta, sino la más baja.
El objetivo de la inducción y el cultivo de cepas modificadas genéticamente es aumentar el rendimiento de la proteína objetivo y reducir los costos. La expresión del gen objetivo no solo se ve afectada por factores propios de la cepa y el plásmido de expresión, sino también por otras condiciones externas, como la concentración del inductor, la temperatura y el tiempo de inducción. Por lo tanto, en general, antes de expresar y purificar una proteína desconocida, conviene estudiar el tiempo y la temperatura de inducción, así como la concentración de IPTG, para seleccionar las condiciones adecuadas y obtener los mejores resultados experimentales.
Fecha de publicación: 31 de diciembre de 2021