El ditiotreitol (DTT) es un agente reductor de uso común, también conocido como el nuevo aditivo verde.Es un compuesto orgánico de pequeño peso molecular con dos grupos mercaptano (-SH).Debido a sus propiedades reductoras y estabilidad, la TDT se utiliza ampliamente en experimentos de bioquímica y biología molecular.
La función principal del DTT es reducir los enlaces disulfuro en proteínas y otras biomoléculas.El enlace disulfuro es una parte importante del plegamiento y la estabilidad de las proteínas, pero bajo ciertas condiciones experimentales, como el análisis SDS-PAGE reducible, la recombinación y el plegamiento de proteínas, es necesario reducir el enlace disulfuro a dos grupos tiol para desentrañar la estructura espacial de la proteína.El DTT puede reaccionar con enlaces disulfuro para reducirlos a grupos mercaptano, abriendo así la estructura espacial de la proteína y haciéndola fácil de analizar y manipular.
La DTT también se puede utilizar para proteger la actividad y la estabilidad de las enzimas.En algunas reacciones catalizadas por enzimas, el oxidante puede reducir la actividad de la enzima.El DTT puede reaccionar con oxidantes para reducirlos a sustancias inofensivas, protegiendo así la actividad y estabilidad de la enzima.
En comparación con los agentes reductores tradicionales como el β-mercaptoetanol (β-ME), el DTT se considera un agente reductor más seguro y estable.No sólo es estable en solución acuosa, sino que también mantiene sus propiedades reductoras en condiciones de alta temperatura y ácido-base.
El uso de la TDT es relativamente sencillo.En general, el DTT se disuelve en un tampón apropiado y luego se agrega al sistema experimental.La concentración óptima de DTT debe determinarse de acuerdo con el experimento específico y generalmente se usa en el rango de 0,1 a 1 mM.Concentraciones más bajas pueden reducir los efectos adversos sobre el crecimiento celular y pueden reducir la citotoxicidad debido a la sobreexpresión de proteínas diana.Concentraciones más altas pueden causar una carga metabólica celular excesiva, afectando el crecimiento celular y la eficiencia de la expresión.
La forma de determinar la concentración óptima puede ser evaluar el nivel de expresión de la proteína diana realizando pruebas de inducción de IPTG a diferentes concentraciones.Se pueden realizar pruebas de cultivo a pequeña escala utilizando una variedad de concentraciones de IPTG (por ejemplo, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, etc.) y el efecto de expresión a diferentes concentraciones se puede evaluar detectando el nivel de expresión de la proteína diana (por ejemplo, Western transferencia o detección de fluorescencia).Según los resultados experimentales, se seleccionó como concentración óptima la concentración con el mejor efecto de expresión.
Además, también puede consultar la literatura relevante o la experiencia de otros laboratorios para comprender el rango de concentración de IPTG comúnmente utilizado en condiciones experimentales similares y luego optimizarlo y ajustarlo de acuerdo con las necesidades experimentales.
Es importante tener en cuenta que la concentración óptima puede variar dependiendo de los diferentes sistemas de expresión, proteínas objetivo y condiciones experimentales, por lo que es mejor optimizar caso por caso.
En resumen, el DTT es un agente reductor de uso común que puede usarse para reducir los enlaces disulfuro en proteínas y otras biomoléculas y para proteger la actividad y estabilidad de las enzimas.Ha sido ampliamente utilizado en experimentos de bioquímica y biología molecular.
Hora de publicación: 28 de septiembre de 2023